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Assisted-Hatching (AHA)

 

     O procedimento do Assisted-Hatching (AHA) foi introduzido pela primeira vez no final de 1980 e consiste numa microassistência para a implantação do ermbrião. A observação de que os pré-embriões que se desenvolviam após o PZD (dissecção parcial da zona pelúcida) possuíam algo que aumentava as taxas de implantação, comparado com a inseminação convencional dos pré-embriões, levando a ideia de criar um furo artificial na zona pelúcida antes da transferência intra-uterina.

 

     Em 1989, a primeira tentativa de AHA foi feita pela Reproductive Biology Associates of Atlanta, GA. Usando uma técnica de PZD, a zona de pré-embriões para teste foi furada e rasgada para criar um pequeno furo.

 

     Entretanto, os resultados iniciais foram promissores, com um moderado aumento nas taxas de implantação de pré-embriões com Hatching mecânico, subsequentemente, outras tentativas falharam em demonstrar uma diferença estatística significante entre o teste e o grupo controle.

 

     Outras análises mostraram que o significado da criação de pequenas aberturas na zona pelúcida de ratos revelou que o Hatching provocou um resultado anormal frequente. O furo causou na zona pelúcida do rato um bloqueio para se tornar afinada como nos blastocistos expandidos. Desta maneira, os blastocistos ficaram parcialmente presos dentro da zona pelúcida.

     Ficou então postulado, que um furo mais aberto poderia facilitar o Hatching in vivo, e como consequência, a implantação.

     Para esse furo mais aberto ser criado na zona, foi testado o meio AT (Ácido de Tyrode’s). Este meio foi previamente usado numa técnica chamada "zona drilling" onde é dissolvida a zona do oócito criando aberturas antes de inseminar, afim de ajudar no processo da fertilização assistida.

 

     Entretanto, o AT mostrou exercer um efeito tóxico leve quando foi usado na zona de oócitos humanos não fertilizados. Esses efeitos foram observados para serem o menos prejudiciais na clivagem dos pré-embriões.

 

     Juntamente com as técnicas de PZD e AT, outros métodos para facilitar o processo do Hatching, têm sido investigados. Isto inclui técnicas invasivas (criando uma abertura na zona) assim como não invasivas (afinando e amolecendo a zona).

     As técnicas invasivas incluem um rasgo mecânico como o PZD, digestão química da zona com AT e um furo por aquecimento utilizando o laser. Como já mencionado, as técnicas de PZD têm sido abandonadas por estarem associadas ao bloqueio do desenvolvimento dos pré-embriões. A digestão com ácido é provavelmente a mais estável e usável procedimento.

     Com a introdução das técnicas com laser, é claramente possível criar uma abertura na zona com tamanho uniforme.

 

     As técnicas não invasivas envolvem o afinamento e/ou amolecimento da zona pelo cultivo do pré-embrião por um tempo curto na presença de uma solução acidificada leve ou Protease.

 

 

     O AHA pode ser realizado nos pré-embriões em qualquer estágio de clivagem, de duas células até blastocisto.

     O melhor estágio celular de desenvolvimento ainda não foi determinado.

    

     O meio com o ácido de Tyrode's teve um grande sucesso com o AHA em pré-embriões humanos em 1991 na Universidade de Cornell. Análises retrospectivas revelaram que algumas pacientes foram altamente beneficiadas por terem os seus pré-embriões manipulados do que as que não tiveram.

     Foi eventualmente determinado, que pré-embriões com a zona pelúcida espessa (> 15 mm), pré-embriões de mulheres com níveis de FSH elevado, e pré-embriões de mulheres com mais de 38 anos, foram os mais beneficiados com a técnica de AHA.

                                                 

     Quando o AHA não selectivo é feito, todos os pré-embriões designados para transferência são manipulados.

     Protocolos selectivos de Hatching requerem um certo critério para avaliar antes de determinar se o pré-embrião é candidato ou não para o procedimento.

     Isto inclui:

     Idade da mulher;

     FSH basal da mulher;

     Número de tentativas feitas sem implantação;

     Grau de fragmentação do pré-embrião;

     Taxa de crescimento do pré-embrião;

     Espessura da zona pelúcida; uniformidade da zona e cor da zona.

     → Falhas de Implantação;

    

EQUIPAMENTO

 

     O equipamento utilizado consiste em:

     Microscópio Invertido Nikon (Eclipse ou Diaphot) com contraste de fase Hoffman equipado com dois manipuladores motor-driven coarse-control

     Dois micromanipuladores hidráulicos (MM-18 e MO - 109 Narishige Co Ltd, Tokyo, Japão).

 

     As micropipetas de holding e hatching são colocadas no segurador e controladas por dois microinjetores IM-6 (Narishige Co Ltd).

 

 

 

TÉCNICA

 

     Após 72 horas (Dia 3) da aspiração dos oócitos, onde os embriões se encontram num estágio de desenvolvimento entre 8 a 10 células faz-se o hatching com a solução de Tyrode's.

 

     É feito o ajuste do micromanipulador. A placa para a realização do procedimento é preparada com uma gota central de 5ml da solução de Tyrode's e rodeada por 8 gotas com meio de injecção onde um embrião deverá ser colocado por gota. Cobrir com óleo mineral.

     O procedimento é realizado em platina aquecedora a 37°C.

 

     Carrega-se a pipeta de hatching com a solução de Tyrode's e com a pipeta de holding fazer a fixação do embrião.

     De seguida, posiciona-se a pipeta de hatching em posição 3 horas, escolhendo um espaço entre dois blastómeros ou uma área de fragmentação embrionária.

     Borrifa-se a solução sobre a zona pelúcida movimentando a pipeta de hatching para cima e para baixo criando um buraco na zona pelúcida. Por fim, remove-se o excesso da solução de Tyrode's.

     Repete-se o procedimento em todos os embriões.

     Lavam-se os embriões em meio de cultura e realizar a transferência 2 horas após o procedimento.

 

 

 

 

 

 

INDICAÇÕES PARA ASSISTED-HATCHING

 

               → Zona pelúcida altamente espessa

     O espessamento da zona pelúcida varia durante o desenvolvimento do oócito ou pré-embrião.

     O afinamento começa entre a primeira e segunda clivagem, e continua progressivamente durante a formação do blastocisto. Na ausência desse afinamento, possivelmente causada pela produção insuficiente de Proteases, o pré-embrião pode ficar preso dentro da zona, abolindo efectivamente qualquer potencial para implantação.

 

 

               → Forma anormal da zona pelúcida/pré-embrião

     Oócitos e pré-embriões com formato oval não são raros. Entretanto, a habilidade dessas mórulas tornarem-se compactas, e se se desenvolverem ao hatching in vitro, é mais lenta do que com os embriões de forma normal, arredondada.

 

     Essa forma irregular de pré-embriões é usualmente associada com a zona pelúcida anormal. O AHA pode ajudar a promover um contacto apropriado de célula para célula, uma compactação e o hatching desses pré-embriões anormais.

 

 

               → Coloração anormal da zona pelúcida

     A zona pelúcida escura (marrom ou amarelada) é algumas vezes observada in vitro.

 

     Nota-se que a zona pelúcida de alguns oócitos, particularmente aqueles pós-maduros, escurecem e deterioram progressivamente com a cultura prolongada. Quando essa característica morfológica está presente, o pré-embrião é considerado um candidato ao AHA.

 



 Este site foi feito no âmbito de um trabalho de Área de Projecto realizado pelos alunos do 12ºE da Escola Secundária da Sé - Guarda
Última actualização: 18/05/07.